【Mục đích sử dụng】

Bộ dụng cụ này là PCR huỳnh quang thời gian thực thăm dò TaqMan để phát hiện định tính ORF1ab, N gen nucleic của 2019-nCoV trong dịch ngoáy họng, đờm ở những bệnh nhân nghi ngờ có các triệu chứng viêm phổi và các trường hợp tụ máu.

Kết quả xét nghiệm chỉ mang tính chất tham khảo lâm sàng và không thể được coi là điểm chuẩn duy nhất cho chẩn đoán lâm sàng. Khuyến nghị nên thực hiện phân tích biểu hiện liên quan đến các triệu chứng lâm sàng và các kết quả xét nghiệm khác.

Người vận hành phải có kinh nghiệm được đào tạo chuyên nghiệp về khuếch đại gen hoặc thử nghiệm phương pháp sinh học phân tử và có bằng cấp phù hợp về vận hành phòng thí nghiệm. Phòng thí nghiệm cần có các biện pháp phòng ngừa và bảo vệ an toàn sinh học hợp lý.

【Nguyên tắc kiểm tra】

Trong bộ này, mồi và đầu dò được thiết kế cho các vùng được bảo tồn và cụ thể của ORF1ab, N của 2019-nCoV, tương ứng. PCR huỳnh quang được sử dụng để phát hiện RNA của virus sau khi tinh chế RNA mẫu bằng axit nucleic.

Bộ xét nghiệm này sử dụng công nghệ PCR huỳnh quang thời gian thực. Trong quá trình khuếch đại PCR, đầu dò liên kết với mẫu và nhóm phóng viên 5 'cuối của đầu dò được phân cắt bởi enzym Taq (hoạt tính exonuclease 5' → 3 '), do đó di chuyển ra khỏi nhóm dập tắt để tạo ra tín hiệu huỳnh quang. Đường cong khuếch đại thời gian thực được vẽ tự động dựa trên tín hiệu huỳnh quang được phát hiện và giá trị Ct của mẫu được tính (Số chu kỳ trải qua khi tín hiệu huỳnh quang trong mỗi ống phản ứng đạt đến ngưỡng lắng). FAM, VIC và các fluorophores đỏ Texas được tối đa hóa để đánh dấu gen ORF1ab, các mẫu dò gen N trong dung dịch phản ứng. Bằng cách sử dụng một bài kiểm tra, việc phát hiện định tính hai gen trên của 2019-nCoV có thể được thực hiện đồng thời.

Để tránh kết quả âm tính giả, bộ kit được cung cấp một bộ kiểm soát nội bộ (IC), được đánh dấu bằng nhóm huỳnh quang Cy5 có thể được sử dụng để theo dõi quy trình chiết xuất và dung dịch phản ứng.

【Những thành phần chính】

Ghi chú¹: Không thể trao đổi các lô linh kiện khác nhau.

Ghi chú²: Bộ thử nghiệm không chứa thuốc thử chiết xuất axit nucleic, vui lòng chuẩn bị thuốc thử trước khi sử dụng.

1. Xử lý mẫu

Thêm 10μL kiểm soát nội bộ vào 200μL kiểm soát tích cực và kiểm soát tiêu cực, tương ứng để thực hiện chiết xuất axit nucleic.

2. Chuẩn bị thuốc thử:

Chuẩn bị hệ thống: Lấy thiết bị đông khô khuếch đại axit Nucleic được cài đặt sẵn, sau đó mở túi giấy bạc và đem đi ly tâm ngay lập tức. Lượng mẫu của mỗi phép thử phải là bội số của 8 chứa một mẫu chứng dương và một mẫu chứng âm tính. Nhỏ 35μL nước không chứa nuclease vào mỗi ống phản ứng.

3. tải mẫu:

Thêm 5μL Axit nucleic mẫu cần kiểm tra, đối chứng dương tính, đối chứng âm tính rằng toàn bộ thể tích phản ứng là 40 μL trong dung dịch phản ứng đã phân bổ. Vì nó không cần một hỗn hợp mịn và chỉ cần đóng nắp ống phản ứng PCR, ly tâm chất lỏng trong thành ống ở đáy ống, do đó xử lý quá trình khuếch đại PCR.

Sau khi xác minh, người ta ước tính rằng việc bổ sung 5μL-10μL dầu Parafin trong hệ thống PCR sẽ không ảnh hưởng đến kết quả PCR nhưng tránh bị nhiễm bẩn và hóa hơi chất lỏng.